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流式細(xì)胞儀的常見問題有哪些?

 更新時(shí)間:2023-09-28 點(diǎn)擊量:1540

流式細(xì)胞儀(flow cytometry,F(xiàn)CM)作為一種強(qiáng)大的單細(xì)胞分析工具,可以對(duì)于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析和分選的高新技術(shù)。那么流式細(xì)胞儀的常見問題有哪些呢?讓我們一起來看看吧!

一、抗體孵育時(shí)間過長會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果嗎?

通常情況下,標(biāo)記細(xì)胞表面抗原的熒光抗體需要在室溫孵育20-30分鐘。

對(duì)于一些狀態(tài)較脆弱的細(xì)胞(例如從組織中分離、培養(yǎng)的免疫細(xì)胞),切勿過長時(shí)間孵育,同時(shí)建議使用染色緩沖液(Staining Buffer),其中主要成分為PBS,疊氮鈉和胎牛血清,胎牛血清可以減少抗體的非特異性結(jié)合,疊氮鈉可以維持細(xì)胞表面抗原的穩(wěn)定性。

對(duì)于胞內(nèi)或者核內(nèi)標(biāo)記抗體,可以在固定、破膜后適當(dāng)延長孵育時(shí)間,或者破核膜同時(shí)孵育核內(nèi)抗體。

二、樣本不能及時(shí)上機(jī)檢測(cè),血樣和組織樣本的保存方法?

通常情況下建議樣本處理至表面抗體孵育結(jié)束,再用1%多聚甲醛重懸固定4℃保存至下一步,或者4%多聚甲醛固定10分鐘后洗去,用StainingBuffer重懸,4℃保存至下一步,48小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。如不具備前處理?xiàng)l件,外周血可以使用流式專用保存管存放,組織樣本剪成小塊后用保存液存放,建議不錯(cuò)過3天進(jìn)行前處理和上機(jī)檢測(cè)。

三、流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期,各個(gè)周期峰分不開,只有一個(gè)寬峰是為什么?

圖片1.png

①如果是持續(xù)出現(xiàn)這種情況,說明儀器的PI檢測(cè)通道CV值過高,管路需要深度清潔或者更換。

②前處理過程中出現(xiàn)的問題,如:乙醇固定條件(濃度、時(shí)間)的改變?cè)斐赏ㄍ覆粀an全、RNA沒有處理wan全、通道CV較差同時(shí)受到異倍體干擾等。

③如果個(gè)別組出現(xiàn)此情況,可能是受到實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件的影響,如:轉(zhuǎn)染的熒光干擾、集中在周期區(qū)間的抑制、對(duì)細(xì)胞影響過大等。

四、鈣離子(Ca2+)流式檢測(cè)如何設(shè)置對(duì)照?

Ca2+檢測(cè)通常使用Fluo-3、Fluo-4等熒光探針,這類探針通常會(huì)在活細(xì)胞內(nèi)與鈣離子結(jié)合發(fā)出熒光,進(jìn)行相關(guān)成像或流式檢測(cè)。因此鈣離子檢測(cè)會(huì)有靜態(tài)檢測(cè)和動(dòng)態(tài)檢測(cè)兩種方法。

靜態(tài)檢測(cè)主要用于檢測(cè)相對(duì)胞內(nèi)濃度變化,需要設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照,以相對(duì)的方式檢測(cè)熒光值。

動(dòng)態(tài)檢測(cè)主要用于檢測(cè)鈣動(dòng)員的情況,監(jiān)測(cè)加入刺激劑后的Ca2+變化情況。通常用于檢測(cè)一些免疫細(xì)胞,也可以用于分析不同淋巴細(xì)胞亞群的變化情況。

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